《Hepatology》解讀：STK24-MASTL-YBX1-PAK4軸——肝細(xì)胞癌侖伐替尼耐藥的新機(jī)制

? 研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球最常見(jiàn)且致死率最高的惡性腫瘤之一，主要由慢性肝病和肝硬化引起。盡管系統(tǒng)治療取得了進(jìn)展，但晚期HCC的預(yù)后仍然很差。侖伐替尼（Lenvatinib）作為一種多激酶抑制劑，通過(guò)靶向VEGFR、FGFR、PDGFR和RET等多種激酶發(fā)揮抗腫瘤作用，已成為HCC的一線治療藥物。然而，侖伐替尼的療效常因腫瘤產(chǎn)生耐藥性而受限，僅能延長(zhǎng)患者數(shù)月的生存期。因此，闡明侖伐替尼耐藥的分子機(jī)制對(duì)于改善臨床結(jié)局和發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白（MASTL）是一種AGC家族激酶，最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制蛋白磷酸酶2A復(fù)合物（PP2A）調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和有絲分裂。近年研究表明，MASTL在多種癌癥中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和治療耐藥，如乳腺癌的放射耐藥、結(jié)腸癌的化療耐藥以及口腔鱗狀細(xì)胞癌的順鉑耐藥。然而，MASTL作為激酶在耐藥相關(guān)信號(hào)通路中的作用研究較少。本研究旨在探索MASTL在HCC侖伐替尼耐藥中的具體機(jī)制，并尋找克服耐藥的新策略。

? 研究結(jié)果

2.1 整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細(xì)胞和組織中高表達(dá)

研究者建立了兩株侖伐替尼耐藥細(xì)胞系（PLC/PRF/5-R和MHCC97H-R），通過(guò)IC50測(cè)定、克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活力檢測(cè)確認(rèn)其耐藥性。同時(shí)，獲取了6例侖伐替尼耐藥或敏感患者的活檢樣本。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析顯示，在耐藥細(xì)胞和組織中有7個(gè)共同上調(diào)基因，其中MASTL因其與多種治療耐藥相關(guān)而被選為研究對(duì)象。進(jìn)一步驗(yàn)證表明，MASTL在耐藥細(xì)胞和組織中表達(dá)顯著升高。研究者還構(gòu)建了獨(dú)特的藥物治療組織芯片，包含52例侖伐替尼治療患者的手術(shù)樣本，免疫組化結(jié)果顯示MASTL高表達(dá)的患者中疾病穩(wěn)定（SD）比例更高，且分層生存分析顯示MASTL高表達(dá)的侖伐替尼治療患者預(yù)后更差。這些結(jié)果突出了MASTL在侖伐替尼耐藥中的潛在重要性。

2.2 MASTL過(guò)表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，研究者發(fā)現(xiàn)包括HCC在內(nèi)的多種癌癥中MASTL在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織。HCC患者中MASTL高表達(dá)與更短的總生存期（OS）相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)通過(guò)5對(duì)HCC樣本及配對(duì)正常組織的qRT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。在TMA1和TMA2隊(duì)列中，MASTL高表達(dá)與惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)，AUC值為0.836，表明其具有較高的診斷準(zhǔn)確性。多變量Cox回歸分析顯示，MASTL高表達(dá)是OS和無(wú)病生存期（DFS）的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。因此，MASTL成為與HCC不良預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。

2.3 MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞侖伐替尼耐藥和體內(nèi)外進(jìn)展

MASTL在不同HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平與侖伐替尼IC50值呈強(qiáng)正相關(guān)。通過(guò)構(gòu)建MASTL過(guò)表達(dá)和敲低的慢病毒載體，研究者發(fā)現(xiàn)MASTL過(guò)表達(dá)降低細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的敏感性，而MASTL敲低則增強(qiáng)敏感性。MASTL過(guò)表達(dá)還促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和自我更新能力。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，MASTL敲低顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥，而MASTL過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)和耐藥。RNA測(cè)序的KEGG分析顯示MASTL高表達(dá)激活MAPK信號(hào)通路，GO分析顯示其與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明MASTL通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路顯著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并賦予侖伐替尼耐藥。

2.4 MASTL通過(guò)促進(jìn)YBX1的磷酸化和核轉(zhuǎn)位促進(jìn)侖伐替尼耐藥

通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，研究者在耐藥細(xì)胞中鑒定了MASTL的相互作用蛋白，并與已發(fā)表的MASTL相互作用數(shù)據(jù)集交叉比對(duì)，最終確定Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）為關(guān)鍵底物。LC-MS/MS數(shù)據(jù)、銀染和免疫印跡驗(yàn)證了MASTL與YBX1的結(jié)合。通過(guò)構(gòu)建截短質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)YBX1的Ala/Pro富集N端（AP）結(jié)構(gòu)域和冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）負(fù)責(zé)與MASTL相互作用。鑒于YBX1在S102位點(diǎn)的磷酸化（p-YBX1）是其活性形式，研究者發(fā)現(xiàn)MASTL表達(dá)變化直接影響p-YBX1水平和YBX1穩(wěn)定性。耐藥細(xì)胞中YBX1磷酸化顯著增加，免疫熒光顯示MASTL與p-YBX1在MASTL過(guò)表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核中強(qiáng)烈共定位。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MASTL過(guò)表達(dá)與YBX1在細(xì)胞核中的過(guò)度磷酸化相關(guān)。通過(guò)敲除YBX1并轉(zhuǎn)染S102突變體（YBX1-S102A），發(fā)現(xiàn)MASTL誘導(dǎo)的侖伐替尼耐藥在YBX1敲除后降低，且不能被突變YBX1的重新表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，表明YBX1的磷酸化對(duì)MASTL介導(dǎo)的耐藥至關(guān)重要。

2.5 磷酸化YBX1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活PAK4促進(jìn)侖伐替尼耐藥

為鑒定YBX1的靶基因，研究者進(jìn)行了RNA測(cè)序和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示MASTL高表達(dá)激活YBX1的轉(zhuǎn)錄功能，在基因組轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近鑒定出更多YBX1結(jié)合區(qū)域。通過(guò)RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)交叉，獲得28個(gè)重疊基因，其中p21激活激酶4（PAK4）因其在調(diào)控細(xì)胞存活和耐藥中的作用被選為研究對(duì)象。ChIP-seq結(jié)果顯示YBX1在PAK4啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明PAK4啟動(dòng)子的-1500至-1000區(qū)域足以介導(dǎo)YBX1的轉(zhuǎn)錄激活，該區(qū)域內(nèi)4個(gè)推定的YBX1結(jié)合位點(diǎn)中，a、b、c位點(diǎn)的突變部分降低YBX1介導(dǎo)的PAK4啟動(dòng)子活性，而聯(lián)合突變完全消除該活性。在YBX1敲除的MASTL過(guò)表達(dá)細(xì)胞中恢復(fù)PAK4表達(dá)，部分挽救了侖伐替尼耐藥的降低，并幫助MASTL重新激活MAPK信號(hào)通路。這些結(jié)果表明PAK4是MASTL介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的關(guān)鍵效應(yīng)分子。

2.6 應(yīng)激激活的STK24導(dǎo)致MASTL在S875位點(diǎn)的磷酸化和激活

MASTL在T194、T299和S875位點(diǎn)存在保守的磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)丙氨酸突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S875突變顯著損害MASTL磷酸化YBX1的能力，表明S875對(duì)MASTL的激酶活性至關(guān)重要。S875突變還降低細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的耐藥性，并阻止MASTL的核轉(zhuǎn)位。將LC-MS/MS免疫共沉淀數(shù)據(jù)與常見(jiàn)人類絲氨酸/蘇氨酸激酶列表交叉比對(duì)，鑒定出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶24（STK24，也稱MST3）是唯一候選激酶。免疫熒光和免疫共沉淀顯示MASTL與STK24存在結(jié)合相互作用。STK24在氧化應(yīng)激和缺氧條件下被磷酸化激活，而侖伐替尼處理以劑量和時(shí)間依賴的方式激活STK24磷酸化。由于缺乏MASTL S875位點(diǎn)的磷酸化特異性抗體，研究者通過(guò)監(jiān)測(cè)MASTL的核定位間接評(píng)估其磷酸化程度。STK24敲低顯著降低MASTL核轉(zhuǎn)位的效率，表明STK24確實(shí)影響MASTL S875的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)突出了S875對(duì)MASTL功能的關(guān)鍵重要性，并提示侖伐替尼可能通過(guò)STK24調(diào)控MASTL磷酸化。

2.7 靶向MASTL的MKI-1通過(guò)抑制MASTL/YBX1/PAK4軸增強(qiáng)侖伐替尼的體內(nèi)療效

臨床樣本證實(shí)，野生型YBX1和磷酸化YBX1在HCC組織中顯著高于配對(duì)正常組織，且其表達(dá)與HCC預(yù)后負(fù)相關(guān)。TMA1隊(duì)列中MASTL、YBX1、p-YBX1和PAK4高表達(dá)頻繁共存，且疾病進(jìn)展（PD）患者相比部分緩解（PR）患者呈現(xiàn)過(guò)度激活的MASTL/YBX1/PAK4軸。鑒于該軸在侖伐替尼耐藥中的關(guān)鍵作用和MASTL的核心調(diào)控地位，研究者選擇MASTL抑制劑MKI-1阻斷該軸。免疫印跡顯示MKI-1以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制MASTL/YBX1/PAK4軸的激活。使用侖伐替尼耐藥患者的腫瘤標(biāo)本構(gòu)建PDX模型，MKI-1處理顯著抑制耐藥腫瘤生長(zhǎng)。在皮下和原位移植瘤模型中，雖然單用侖伐替尼效果有限，但MKI-1或PAK4抑制劑CZh226聯(lián)合侖伐替尼顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且MKI-1聯(lián)合侖伐替尼的療效優(yōu)于其他治療組合。此外，聯(lián)合治療未引起體重變化或明顯副作用。在5例MASTL高表達(dá)患者來(lái)源的PDX模型中，聯(lián)合治療同樣顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。

? 研究結(jié)論

本研究揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸是驅(qū)動(dòng)HCC侖伐替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。侖伐替尼暴露下，應(yīng)激激活的STK24磷酸化MASTL的S875位點(diǎn)，激活MASTL的激酶功能；活化的MASTL進(jìn)而磷酸化YBX1的S102位點(diǎn)，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位并激活轉(zhuǎn)錄因子功能；磷酸化YBX1轉(zhuǎn)錄激活PAK4，通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，最終導(dǎo)致侖伐替尼耐藥。靶向抑制該軸（特別是使用MASTL抑制劑MKI-1）可在體內(nèi)外模型中顯著增強(qiáng)侖伐替尼的療效，為克服HCC侖伐替尼耐藥和改善患者臨床結(jié)局提供了潛在的新型治療策略。未來(lái)研究應(yīng)聚焦于開(kāi)發(fā)強(qiáng)效MASTL抑制劑，并在臨床環(huán)境中評(píng)估其療效，以確認(rèn)其在減輕侖伐替尼耐藥方面的潛力。

? 研究思路

該研究遵循"現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)→機(jī)制探索→功能驗(yàn)證→轉(zhuǎn)化應(yīng)用"的經(jīng)典研究范式：

1.臨床問(wèn)題出發(fā)：針對(duì)HCC侖伐替尼耐藥的臨床難題，建立耐藥細(xì)胞系和獲取患者樣本；

2.組學(xué)篩選靶點(diǎn)：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)整合分析，篩選出關(guān)鍵耐藥基因MASTL；

3.臨床相關(guān)性驗(yàn)證：利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、臨床樣本和組織芯片，驗(yàn)證MASTL與HCC預(yù)后和侖伐替尼療效的關(guān)系；

4.功能機(jī)制研究：通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確MASTL促進(jìn)耐藥和腫瘤進(jìn)展的功能，并深入解析其下游分子機(jī)制——MASTL→YBX1磷酸化/核轉(zhuǎn)位→PAK4轉(zhuǎn)錄激活→MAPK通路激活；

5.上游調(diào)控機(jī)制：發(fā)現(xiàn)STK24作為應(yīng)激響應(yīng)激酶，在侖伐替尼刺激下激活并磷酸化MASTL的S875位點(diǎn)，啟動(dòng)整個(gè)信號(hào)軸；

6.轉(zhuǎn)化應(yīng)用驗(yàn)證：使用MASTL抑制劑MKI-1和PAK4抑制劑CZh226，在多種體內(nèi)模型（皮下瘤、原位瘤、PDX模型）中驗(yàn)證聯(lián)合用藥克服耐藥的效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Liang BG, Zheng YM, Xu MH, Gao C, Xu WX, Chen JB, Wang SW, Zhao LT, Yang GH, Yuan L, Ma AY, Dong ZN, Cai JB, Sun HC, Ke AW, Shen YH. The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC. Hepatology. 2026 Apr 1;83(4):771-788. doi: 10.1097/HEP.0000000000001392.