經(jīng)典古方下瘀血湯（XYXD）通過重塑腸道菌群平衡，激活FXR-SHP軸以維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)，并最終調(diào)控m?A轉(zhuǎn)錄后修飾影響花生四烯酸（AA）代謝，從而多維度緩解代謝相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）。成果發(fā)表在Phytomedicine期刊（IF：8.3）

原文：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711326002606?via%3Dihub

Phytomedicine 是一本專注于植物療法、天然產(chǎn)物及傳統(tǒng)藥物（包括中藥）藥理活性研究的國(guó)際同行評(píng)審期刊。期刊創(chuàng)刊于1994年，由愛思唯爾（Elsevier）出版。該刊涵蓋植物藥理學(xué)、毒理學(xué)、臨床療效及藥物相互作用等主題，尤其關(guān)注天然產(chǎn)物在治療人類疾病中的科學(xué)證據(jù)。最新影響因子（IF）為8.3（2025年數(shù)據(jù)），5年影響因子為8，屬于中科院醫(yī)學(xué)一區(qū)（Top期刊）。由愛思唯爾出版，印刷國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物號(hào)（ISSN）為0944-7113。

研究背景：

代謝相關(guān)脂肪性肝病（MAFLD）是全球最常見的慢性肝病，其中約33%-50%的患者可能發(fā)展為代謝相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）。MASH可進(jìn)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC），是肝移植的第二大原因，但有效治療藥物匱乏。MASH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及肥胖、胰島素抵抗、炎癥和纖維化等多重因素。近年來，“腸-肝軸”理論成為研究熱點(diǎn)：腸道菌群失調(diào)及其代謝物（尤其是膽汁酸BA）的改變，通過門靜脈進(jìn)入肝臟，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)MASH進(jìn)展。法尼醇X受體（FXR）是維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)的核心核受體，其活性受腸道菌群代謝物的精細(xì)調(diào)控。此外，N?-甲基腺苷（m?A）這一表觀轉(zhuǎn)錄組修飾也被發(fā)現(xiàn)與肝臟炎癥密切相關(guān)，并可能受菌群代謝物（如膽汁酸）的調(diào)節(jié)。然而，天然復(fù)方如何通過“腸-肝軸”系統(tǒng)性調(diào)控MASH，其具體機(jī)制尚不明確。下瘀血湯（XYXD）是源自張仲景《金匱要略》的經(jīng)典方劑，由大黃、桃子和土鱉蟲組成。既往研究證實(shí)其對(duì)肝纖維化和肝癌有改善作用，但其對(duì)MASH的治療效果及通過“腸-肝軸”的具體機(jī)制尚未闡明。

研究方法：

研究人員通過MCD飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠MASH模型，給予低劑量和高劑量XYXD干預(yù)，以?shī)W貝膽酸（OCA）為陽性對(duì)照。為明確XYXD的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，團(tuán)隊(duì)利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對(duì)XYXD提取物進(jìn)行指紋圖譜及17種標(biāo)志性成分的含量測(cè)定。在表型評(píng)估層面，采用試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST及肝臟TG水平，并結(jié)合H&E、油紅O及天狼星紅染色評(píng)價(jià)肝臟病理改變。在機(jī)制探索層面，通過16S rRNA基因測(cè)序分析腸道菌群組成；利用LC-MS/MS技術(shù)定量檢測(cè)血清、肝臟和糞便中39種膽汁酸及花生四烯酸（AA）代謝物；通過Dot blotting和MeRIP-qPCR檢測(cè)整體及特定基因（如Fads1）的m?A修飾水平。此外，利用脫氧膽酸（DCA）刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞，并加入XYXD含藥血清，通過RT-qPCR、Western blot及Dot blotting驗(yàn)證DCA對(duì)m?A修飾和炎癥的調(diào)控作用。上述方法的整合，從化學(xué)成分、動(dòng)物表型、腸道菌群、代謝物譜到表觀轉(zhuǎn)錄組修飾，多維度證明了XYXD通過“菌群-膽汁酸-m?A-脂質(zhì)代謝”軸治療MASH的核心機(jī)制。

主要研究結(jié)果：

1. XYXD的化學(xué)成分分析

采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS）技術(shù)，對(duì)下瘀血湯（XYXD）總提取物及17種對(duì)照品混合物進(jìn)行分析，獲取了典型的指紋圖譜，并附有相應(yīng)標(biāo)志性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。同時(shí)定量測(cè)定了17種標(biāo)志性化合物的含量，為后續(xù)藥效學(xué)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。其中苦杏仁苷含量最高（8.13 mg/g），兒茶素含量極低（0.00035 mg/g）。

圖1，UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS鑒定XYXD成分

2. 下瘀血湯（XYXD）能有效改善MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠MASH

為明確下瘀血湯（XYXD）對(duì)MASH的治療效果，研究者采用MCD飲食誘導(dǎo)小鼠MASH模型，給予低劑量（2.6 g/kg）和高劑量（5.2 g/kg）XYXD口服治療，以?shī)W貝膽酸（OCA）為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，與MCS正常對(duì)照組相比，MCD模型組小鼠肝臟呈彌漫性黃色，血清ALT、AST及肝臟TG水平均顯著升高（P < 0.001），H&E、天狼星紅及油紅O染色顯示嚴(yán)重的脂肪變性、膠原沉積和脂質(zhì)積聚。經(jīng)XYXD和OCA治療后，肝臟顏色和質(zhì)地顯著改善，ALT、AST及TG水平顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），病理染色顯示的脂肪變性、炎癥浸潤(rùn)、膠原沉積和脂質(zhì)積聚均明顯減輕，NAS評(píng)分也顯著降低。以上結(jié)果表明，XYXD能夠有效緩解MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠MASH。

圖2，XYXD有效改善MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠MASH

3. XYXD調(diào)控MASH中的脂代謝

為闡明XYXD在MASH中對(duì)脂代謝的調(diào)控作用，研究者檢測(cè)了脂代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平，包括脂肪酸攝取基因（CD36、CIDEC、PLIN2）、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)基因（DGAT1）、脂肪酸合成基因（SREBP1c、FASN）以及脂肪酸β-氧化基因（CPT1a、ACOX1）。結(jié)果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠肝臟中CD36、CIDEC、PLIN2、DGAT1、SREBP1c和FASN的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P < 0.001），而CPT1a和ACOX1的表達(dá)水平顯著降低（P < 0.001）。經(jīng)XYXD和OCA治療后，上述基因的表達(dá)變化均被顯著逆轉(zhuǎn)（P < 0.01）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，XYXD治療顯著下調(diào)了CD36和SREBP1c的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)了CPT1a的蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果證實(shí)，XYXD能夠調(diào)節(jié)MCD誘導(dǎo)的MASH小鼠的脂代謝紊亂。

圖3，XYXD對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的MASH小鼠脂代謝的影響

4. XYXD改善MASH鼠炎癥反應(yīng)和纖維化

為探討XYXD對(duì)MASH炎癥和纖維化的影響，研究者檢測(cè)了炎癥及纖維化相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠肝臟中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P < 0.05），巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物CD11b和F4/80的mRNA表達(dá)也顯著升高（P < 0.001），免疫熒光和免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)CD11b和F4/80呈陽性表達(dá)。經(jīng)XYXD和OCA治療后，上述促炎因子和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)均顯著降低（P < 0.05或P < 0.001）。此外，天狼星紅染色顯示XYXD治療可改善MCD小鼠的纖維沉積，纖維化相關(guān)基因α-SMA和COL1A1的mRNA表達(dá)也顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，XYXD能夠有效減輕MASH小鼠的炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。

圖4，XYXD改善MASH 鼠炎癥反應(yīng)和纖維化

5. XYXD調(diào)控MASH鼠腸道菌群

為探究XYXD對(duì)MASH小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，研究者對(duì)糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序分析。結(jié)果顯示，與MCS組相比，MCD模型小鼠腸道菌群的α多樣性降低，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比值升高。經(jīng)XYXD治療后，上述菌群失調(diào)被顯著逆轉(zhuǎn)：XYXD顯著增加了有益菌如擬桿菌屬（Bacteroides）、副擬桿菌屬（Parabacteroides） 及多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron） 的豐度，同時(shí)降低了促炎菌如糞桿菌屬（Faecalibaculum） 和乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 的豐度。LEfSe分析進(jìn)一步揭示了各組間的差異菌群特征。以上結(jié)果表明，XYXD能夠有效重塑MASH小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，恢復(fù)菌群穩(wěn)態(tài)。

圖5，XYXD對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的MASH小鼠腸道菌群失調(diào)的影響

6. XYXD調(diào)節(jié)膽汁酸代謝

為探究XYXD對(duì)MASH小鼠膽汁酸（BA）代謝的調(diào)控作用，研究者檢測(cè)了血清總膽汁酸（TBA）水平及BA代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠血清TBA含量顯著升高，同時(shí)肝臟中FXR、SHP、CYP27A1、MRP3和NTCP的mRNA水平顯著降低（P < 0.001），而膽汁酸合成限速酶CYP7A1的mRNA水平顯著升高（P < 0.001）。經(jīng)XYXD治療后，FXR、SHP、CYP27A1、MRP3和BSEP的mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.01或P < 0.05），CYP7A1的表達(dá)被顯著下調(diào)（P < 0.01）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，XYXD干預(yù)后FXR、SHP和BSEP的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而CYP7A1的蛋白表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明，XYXD通過激活FXR-SHP信號(hào)通路，有效調(diào)節(jié)了MASH小鼠的膽汁酸代謝穩(wěn)態(tài)。

圖6，XYXD調(diào)節(jié)膽汁酸代謝

圖7，XYXD對(duì)MASH小鼠血清、肝臟和糞便中膽汁酸（BA）含量的影響

7. XYXD通過降低脫氧膽酸（DCA）水平來調(diào)控m?A修飾

為探究XYXD是否通過調(diào)節(jié)m?A修飾發(fā)揮作用，研究者檢測(cè)了小鼠肝臟m?A水平及相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，MCD組小鼠肝臟m?A水平顯著升高，而XYXD處理后顯著降低了m?A水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，XYXD顯著降低了血清和肝臟中脫氧膽酸（DCA）的含量，以及腸道中產(chǎn)DCA的關(guān)鍵菌屬——梭菌屬（Clostridium）的豐度，同時(shí)下調(diào)了催化CA轉(zhuǎn)化為DCA的功能基因baiE的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DCA刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞可顯著上調(diào)m?A水平及m?A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/METTL14的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)；而XYXD含藥血清處理可顯著逆轉(zhuǎn)DCA誘導(dǎo)的這些效應(yīng)。相比之下，牛磺膽酸（TCA）對(duì)m?A水平無明顯影響。以上結(jié)果表明，XYXD通過減少腸道梭菌屬豐度、降低DCA水平，進(jìn)而下調(diào)m?A修飾，減輕炎癥反應(yīng)。

圖8，XYXD和DCA均可調(diào)控m?A的水平

8. XYXD通過m6A修飾調(diào)控花生四烯酸代謝，從而抑制環(huán)氧合酶和脂氧合酶信號(hào)通路。

在本部分中，研究者主要探討了XYXD通過m6A修飾調(diào)控花生四烯酸（AA）代謝，從而抑制環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）信號(hào)通路。體外實(shí)驗(yàn)顯示，脫氧膽酸（DCA）可上調(diào)巨噬細(xì)胞中FADS1的mRNA表達(dá)，增加AA含量，并降低二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）水平；而XYXD含藥血清則可逆轉(zhuǎn)這些變化。MeRIP-PCR結(jié)果表明，XYXD顯著下調(diào)FADS1的m6A修飾水平。在MASH小鼠模型中，XYXD處理可降低COX通路代謝產(chǎn)物PGE2、PGD2及LOX通路代謝產(chǎn)物15-HETE、5-HETE的水平，并抑制FADS1、PTGS1、PTGS2、ALOX5、ALOX12、ALOX15等關(guān)鍵基因及FADS1、ALOX5、COX2蛋白的表達(dá)。綜上，XYXD通過降低DCA含量、調(diào)控m6A修飾，進(jìn)而抑制FADS1介導(dǎo)的AA合成及COX/LOX代謝通路，緩解MASH相關(guān)炎癥。

圖9，采用LC-MS/MS技術(shù)評(píng)估了花生四烯酸（AA）的代謝物

9. 全文總結(jié)

圖10，XYXD對(duì)MASH的保護(hù)機(jī)制示意圖

研究首次揭示了下瘀血湯（XYXD）通過“腸道菌群-膽汁酸-m?A修飾-花生四烯酸代謝”軸改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）的整合機(jī)制，創(chuàng)新性地將表觀轉(zhuǎn)錄修飾（m?A）與腸道微生物及脂質(zhì)代謝聯(lián)系起來，證明了XYXD通過降低脫氧膽酸（DCA）水平、下調(diào)FADS1的m?A修飾、進(jìn)而抑制COX/LOX炎癥通路的核心作用。研究亮點(diǎn)在于多組學(xué)聯(lián)用（16S rRNA、LC-MS/MS、MeRIP）及體內(nèi)外驗(yàn)證，系統(tǒng)闡明了中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)機(jī)制。然而文章也有若干不足之處：未明確XYXD中具體哪種活性成分發(fā)揮關(guān)鍵作用；未在MASH患者中驗(yàn)證該機(jī)制；對(duì)m?A修飾調(diào)控FADS1的直接證據(jù)（如突變實(shí)驗(yàn)）尚待補(bǔ)充；此外，MCD模型雖常用但缺乏代謝綜合征背景（如肥胖、胰島素抵抗），可能影響結(jié)果向臨床的轉(zhuǎn)化。